热门:【学术前沿】伊成器、宋春啸等全面总结DNA和RNA修饰的检测做法和研究困

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迄今为止鉴定的dna和rna修饰分别超过17种和160种，这些修饰的生物学功能的有趣促进了表观基因组学和表观转录组学的建立和迅速发展。 知道基因组和转录组受到了特定的修饰是分析生物学功能的关键。 测序技术的迅速发展使dna/rna修饰图像的制作成为可能，但引起了新的问题和思考。

最近，北京大学伊成器队和牛津大学宋春啸队合作在protein & cell发表了特邀综述“MaPPingtheePigeneticmodificationsofdnaandrna”，该篇现在的高通量很高。

dna修饰在个人发育【1】、衰老【2】、癌症【3】中起着重要的功能。 这些修饰不妨碍watson-crick配对，但影响蛋白质和dna的结合。 在哺乳动物基因组中，胞嘧啶第五个碳原子的甲基化(5-甲基胞嘧啶、5 -甲基胞嘧啶或5mc )是丰度最高的dna修饰型，也被称为“第五个碱基”【1】。 5mc由dna甲基化酶dnmts催化，主要丰富存在于cpg岛上。 5mc的分布具有组织特异性，但cpg岛的70-80%具有5mc修饰【4】。 5 -羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine或5hmc )，也被称为第6碱基，是tet1酶氧化5mc而成的。 5hmc的进一步氧化产生5 -甲酰胞苷( 5fc )和5 -羧基胞苷(5cac )。

和dna一样，rna也有多种修饰，同时这些修饰与rna代谢全方位相关。 近年来，利用高通量测量序列鉴定dna/rna修饰部位的技术在很大程度上支持了表观遗传学和表观遗传学的研究。

单核苷酸水平dna修饰部位的鉴定

1. 5mc的部位鉴定

亚硫酸氢钠测序( bs-seq )被认为是5mc鉴定的金标准，亚硫酸氢盐不影响甲基化c，将未甲基化的c转化为u (尿嘧啶)，后者通过pcr反应转化为t，被甲基化c。 结合高通量测量序列技术，可以得到单核苷酸分辨率的全基因组5mc修饰图像。 亚硫酸氢盐转换未甲基化c的效率高达99%，这种做法的接受度最高【57】。 但是，亚硫酸氢盐的解决导致dna的分解【8】，限制了其在稀有贵重样品中的应用。 另外，由于占基因组95%的未甲基化c转化为t，测序片段的匹配基因组效率下降，也带来了视感度的偏好性。 最后需要指出的是，bs-seq无法区分5mc和5hmc。

最近开发出了两种无亚硫酸氢盐的5mc鉴定方法，分别是taps ( Tet-assistedpyridineboranesequencing )【9】和em-seq(enzymaticmethyl-)。 taps的假阳性率低于bs-seq，可以检测少量的dna(1ng )。 另外，配合过氧化钾可以区分5mc和5hmc。 em-seq利用tet和dna脱氨酶apobec3a，灵敏度比bs-seq高。

2. 5hmc、5fc和5cac的部位鉴定

要详细了解5hmc、5fc和5cac的功能，必须正确绘制基因组上的分布。 oxbs-seq ( oxidativebisulfitesequencing )【11】和ta B- seq ( Tet-assistedbisulfitesequencing )【12， 12 HMC-CATCC ( chemical-assistant c-to-t conversion of5HMC sequencing )【14】和ace-seq(apobec-cout) 5fc的检查方法是 MA B-SEQ ( methylase-assistedbisulfitesequencing )【18】和FC-CET 5cac的检查主要使用CAB SEQ ( chemical modification-assistedbisulfitesequencing )【21】。 值得注意的是，上述测序技术都是基于化学方法的，目的是通过将携带修饰或未修饰的c转换为t，来区别c是否携带修饰，在单碱基水平上鉴定dna修饰位点。

3 .抗体检测dna甲基化

基于抗体的dna修饰部位的鉴定是以前就传下来的，是广泛使用的比较简单的方法。 现在5mc、5hmc、5fc、5cac有商业化的抗体，可以作为dna ip(dna immunoprecipitation，dip )。 利用5hmc-dip可以鉴定癌症患者血液中dna循环的5hmc【22】，这种做法证明灵敏度高，不需要消耗大量dna，具有临床应用潜力。 但是，dip不能提供单碱基精度的dna修饰分布位点，检测特异性很大程度上取决于抗体本身的性质，背景(抗体和dna的非特异性结合)高是因为在进行dip时需要设置严密的对照，更慎重地验证结果。

4. dna 6ma的测序鉴定

尽管哺乳动物基因组中6ma的含量远远低于5mc，但近年来受到了更多的关注。 dna 6ma的测序表明，以6ma抗体识别负载该修饰dna片段的dna片段为主，具有很高的假阳性【23】。 因为6ma是细菌中丰度最高的dna修饰型，在该哺乳动物中6ma的鉴定很容易受到细菌污染的影响。 高精度无污染的质谱鉴定表明哺乳动物基因组dna 6ma的含量非常低，但最近的研究表明6ma丰富地存在于线粒体中，具有重要的功能【24】。 最近，bioart总结了哺乳动物6ma的研究历史和争论。 请参阅以下内容。

不同dna修饰的测序方法总结

rna修饰的生物发生与鉴定

1. mrna内部最丰富的修饰: m6a

m6a是真核生物mrna内部丰度最高的修饰，主要由mettl3、mettl14和其他蛋白质(包括wtap、virma、hakai、zc3h13和rbm15/15b )组成的甲基转移酶复合体催化剂【25-29】 另一个m6a甲基转移酶是mettl16，是催化mat2a mrna的m6a。 m6a的去除通过fto和alkbh5。 因为这个m6a是可逆的rna修饰。

目前有多种m6a高通量鉴定技术，尽管广泛应用于m6a研究，我们仍然需要对特定的检查方法保持谨慎的态度。 根据m6a-seq技术，m6a抗体的非特异性结合有可能成为假阳性。 最近，开发了使用特征性端粒酶识别负载m6a的序列【30，31】的非抗体依赖的m6a检测方法，但由于端粒酶的活性限制，该方法只能识别m6a motif的一部分。 用化学标志物鉴定m6a的方法【32，33】受化学反应效率的影响很大。 因此，新的m6a鉴定方法的开发依然发挥着重要的作用。

更多的证据支持m6a在生命活动中的重要性，但引起了很多疑问。 1)fto的基质和功能。 一些研究以fto为m6a脱甲基化酶开展了功能研究，实际上fto说明了包括mrna的m6a和m6am、trna的m1a和snrnam6am等在内的多种催化剂基质()，fto如何选择控制不同的基质和细胞 2)m6a在可变剪辑中的功能。 m6a甲基化酶、脱甲基化酶、阅读蛋白都对可变切断【34-36】有影响，但在mes中m6a不是切断rna所必须的【37】。 因此，m6a如何直接或间接影响切断需要进一步研究。 3 ) m6a在抗病毒反应中的功能。 目前，m6a发现可以修饰寨卡病毒( zikv )、丙型肝炎病毒( hcv )、a型流感病毒( iav )和人免疫缺陷病毒( hiv )的rna (新型冠状病毒rna也存在丰富的修饰，详见此前报告:。 m6a可以抑制zikv病毒的感染【38】，但可以促进iav病毒的表达【39】。 但是，目前还不清楚m6a如何控制病毒rna的命运，以及为什么对不同病毒的作用不同。

2. m6am修饰

真核生物mrna 5‘帽子后的第一个a具有2o甲基化( am )时，被甲基化酶pcif进一步催化到m6am。 但是，现在的m6am测序方法都是用m6a抗体( m6a抗体可以识别m6a和m6am )辅助其他分解。 因此，有必要开发更特异的m6am鉴定方法。 另外，m6am的功能还有很大的争议。 m6am最初被鉴定为与rna稳定性相关的【40】，在随后的研究中发现m6am只影响mrna的半衰期【41】的一小部分，m6am也影响mrna的翻译效率【42】。 因此，m6am的mrna命运决定有待进一步研究。

3. m1a修饰

m1a是m6a的异构体，甲基不是与n6位结合，而是与n1结合。 m1a丰富地存在于trna、rrna、mrna中。 甲基转移酶复合体trmt6-trmt61a介导mrna上的m1a，另一复合体trmt61b和trmt10c介导线粒体mrna上的m1a。 m1a的脱甲基化由alkbh1、alkbh3和fto负责。

最近，多个独立课题组开发的高通量测量序列(包括m1a-id-seq【43】、m1a-seq、m1a-map【44】和m1a-seq-tgirt【45】)

4. m5c、hm5c和ac4c修饰

trna、rrna、mrna均有m5c修饰，其中mrna上的m5c由nsun催化。 参考dna 5mc的鉴定方法，m5c也可以用改良的亚硫酸氢盐测序法进行单核苷酸精度的鉴定【46，47】，但同样面临rna分解的问题。 aza-ip和miclip是不需要亚硫酸氢盐的m5c鉴定方法，但需要过表达甲基化酶，有可能无法真实反映假阳性和真实条件下m5c的分布。 目前，hm5c和ac4c的鉴定都依赖于相应的抗体，不能达到单碱基精度。 因此，将来期待更正确的m5c、hm5c、ac4c的检查方法。

5 .假尿嘧啶ψ修饰

尿嘧啶ψ被认为是rna的第五个碱基，是rna上最丰富的修饰型，聚焦于trna、rrna、snrna、mrna。 尿嘧啶的生成依赖于两种尿嘧啶合成酶( pseudouridine synthases，PUSS ) :“stand-alone”PUS不需要因子( cofactor )，rna依赖的PUS需要SS h / 假尿嘧啶与ncyclohexyln’β- (4methylmorpholinium ) CMC ( Ethylcarbodiimide )反应生成cmc-Ψ，影响逆转录反应，因此目前mrna中约有2000个假尿嘧啶

6. m7g修饰

m7g是trna和mrna‘帽子的古典修饰，但最近的研究表明MRNA内部也存在m7g修饰。 mettl1-wdr4复合体可以在trna和一些mrna的内部加入m7g。 目前有基于抗体和化学方法的m7g检测技术( m7g-merip-seq【50】和m7g miclipseq【51】)。 这些技术使得mrna内部的m7g被认为与翻译有关。 但是，考虑到m7g在trna上的丰富性，今后的研究需要更慎重地区分m7g在不同rna上的功能。

不同rna修饰的结构及其相关测定测序鉴定方法总结

长读段测序在dna/rna修饰检测中的应用

上述测序技术都受测序长度的限制，但三代测序可以读取长片段，同时具有直接取得dna/rna修饰(不需要抗体或化学解决)的潜力，具有重要作用。 修饰改变了核苷酸匹配的效率，smrt测序通过检测荧光标记不同的dntp/ntp结合目标核苷酸的时间差来计算单核苷酸精度的修饰【52】。 另外，修饰会改变核苷酸的电信号，但nanopore测序会通过检测通过纳米孔的核苷酸的电信号来计算携带的修饰【53】。 这两种三代测序技术有很好的应用前景，但目前的计算方法和技术还存在很高的假阳性，需要进一步改进和提高。

总结和展望

总结来说，dna/rna修饰的鉴定技术不断更新，显示了dna/rna修饰在生命活动中的重要功能。 但是，未来仍有必要对修饰部位进行单碱基精度的检查，分析这些修饰如何影响rna的命运，参与各种生理过程。

原文链接:

link.springer/content/PDF/10.1007/s 13238-020-00733-7.PDF

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原标题:“【学术前沿】全面总结伊成器、宋春啸等dna和rna修饰的检查方法和研究困境”

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